單寧酶開題報告模板

　　單寧酶是一種水解酶，能水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵，生成沒食子酸和其他化合物。在酶制劑工業發達的國家，如日本、美國，單寧酶的基礎理論和應用研究工作開展得較早，并已在茶飲業中取得了較好的經濟效益。隨著國民經濟的不斷發展，人們生活水平的不斷提高，單寧酶得到了更廣泛的應用。人們已在皮革業、飼料業、化妝品業等方面開發了單寧酶的多種用途。中國是個茶葉大國，而且可開發資源豐富，單寧酶的應用前景十分廣闊。 單寧酶的性質國外對單寧酶性質的研究相對較多，也較深入，為今后的應用研究提供了有價值的參考。 單寧酶的酶學性質來源于不同菌種的單寧酶動力學性質稍有區別。Yamada H. 等報道的黃曲霉單寧酶活性穩定pH值范圍最窄，為5. 0～5. 5另據韓國的Chae Soo-Kyu 等報道的曲霉菌種AN-11單寧酶活性穩定的pH值為5. 0～6. 5其他菌種單寧酶活性穩定pH 范圍大都在3.0～8.0之間，最適pH值為4～6，熱穩定范圍在70～80 ℃以下，最適反應溫度為35～ 60 ℃。日本科學家Hdeaki

　　-4 Yamada等就底物濃度對黃曲霉的影響進行了研究，測出Km (以單寧為底物) 為0.5×10

　　-4mol/L; Km (以葡萄糖212沒食子酸為底物) 為1.4×10mol/L；Km (以沒食子酸甲酯為底物)

　　-4為8.6×10mol/L。經6mol/L鹽酸胍處理后，單寧酶將發生不可逆失活，各種金屬離子以及

　　EDTA 對酶活性影響報道結論不一。

　　單寧酶的物理化學性質

　　純單寧酶在紫外光區280nm 處，有一個最大吸收峰，在濃度為10% ，比色皿為1 cm×1 cm 條件下，吸光系數a為11.8，260nm處吸光度與280nm處吸光度之比為0. 51。

　　Sadaak i Iibuchi，Chae Soo-Kyu分別用凝膠過濾法測定出它們各自選育的菌種單寧酶相對分子質量都為200 000。O sao A dachi等分別用沉降法和電泳法測定黃曲霉單寧酶相對分子質量，分別是194 000和192 000。Chantal等測出黑曲霉LCF8單寧酶相對分子質量為186 000，其等電點在4左右。Chantal和Chae Soo-Kyu在對各自提純的酶進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時發現，單寧酶分子由2種亞基組成，但這個結果與Kengi Aoki對酵母單寧酶結構分析的結果有所不同。后者用同樣的方法，只得到一條電泳蛋白帶。

　　O sao A dachi等進一步研究了黃曲霉單寧酶的其他結構特性，其分子中氮含量為12.9% (凱氏定氮法)，用二硝基氟苯法測氨基末端，有2個DNP-氨基酸產物，分別為DNP-丙氨酸與DNP-精氨酸,這一結果進一步指明黃曲霉單寧酶為2種亞基組成。單寧酶另一重要特征是，它為一種糖蛋白，而不同來源的單寧酶糖含量有差異。例如，黃曲霉單寧酶糖基占總相對分子質量的25% ，糖基為甘露糖。Chantal從黑曲霉中提取的單寧酶，其糖基含量高達43% ，而酵母單寧酶糖基含量為62%。Parthasarathy N. 等探明其選育的黑曲霉單寧酶碳水化合物為

　　葡萄糖和甘露糖，肽鏈通過絲氨酸和蘇氨酸與糖基相連接。糖基與酶的功能關系還未見報道。 單寧酶的催化性質

　　Saddak i Iibuchi等對米曲霉單寧酶的催化途徑、底物的專一性和阻遏作用進行了研究。結果表明，單寧酶催化葡萄糖酸酯，水解成沒食子酸與葡萄糖。中間產物為1，2，3，4，6-黃酰單寧和2，3,4，6-四酰單寧以及兩種沒食子酸葡萄糖。反應途徑如下所示：

　　單寧酶只能水解沒食子酸化合物中的酯鍵，不對底物類似物如甲基間二羥甲酸鹽起作用。酶對底物是否有催化作用決定于ES復合物的形成。ES復合物形成條件有3點：a.只要是沒食子酸形成的酯,對醇沒有限制；b.酚羥基在苯環上相對位置不同，將影響其與酶的結合作用；c.形成的ES復合物中酚羥基形成的酯鍵可被水解，而其他酯鍵或羧基由于沒有直接與酶結合，不能發生以上的反應。酶反應受到含酚羧基的底物類似物的競爭性抑制，但2,6--二羥基苯甲酸是非競爭性抑制。這表明盡管底物與酶結合的復合物都是沒食子酸化合物，但因酶與底物結合位點不同，它對某些酚羥基底物起作用，而對另一些底物類似物又不起作用。 單寧酶的來源

　　單寧酶主要來源于微生物，菌種主要為曲霉菌。另外，青霉、酵母、細菌、植物也有產單寧酶的報道，國外資料報道的各種產酶菌種列于表1. 這些菌種都是以單寧作為誘導物來產生

　　單寧酶的，充分證明單寧酶為一種誘導酶。Doi Seniji等從基因表達調控方面對菌種產生單寧酶進行了探索, 證明指導單寧酶生物合成的mRNA極不穩定, 而放線菌酮可迅速阻止單寧

　　酶的產生。

　　單寧酶的提取與純化

　　單寧酶的提純技術隨著蛋白質提純技術的進步而不斷提高。在分離純化此酶的過程中，主要困難表現在破壁取酶。曲霉單寧酶為胞內酶，它分布于真菌的細胞壁與細胞膜之間，結合得非常牢固，可以認為是固定在細胞中。要充分提取酶，首先面臨的是如何有效地破壁，使酶最大限度地釋放出來。利用超聲波、石英砂研磨、滲透法等經典方法破壁時，酶得率較低。法國科學家利用凍融法，再加入伴刀豆球蛋白(凝集素) 破壁，此法是在菌種產酶高峰過后， 待胞壁韌性降低時采用的，酶得率雖較第一類方法有所提高，但損失仍然嚴重。翌年，他們將生產幾丁質酶的鏈霉素菌絲體與產單寧酶菌種保溫培養一段時間后，53%的胞內酶得以釋放。在此之前，也有關于幾丁質酶、α-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶破壁的報道。酶法破壁大大提高了酶得率，但也不可避免地給后期提純工作帶來了麻煩。單寧酶的分離提純手段大致可以歸納為以下幾條路線：

　　硫酸銨沉淀

　　A、 細胞破壁（物理方法）→利凡諾（乳酸-6，9-二氨基-7-氧基吖啶）沉淀→ 丙酮沉淀

　　陰離子交換柱→葡聚糖凝膠過濾

　　B、 細胞破碎（物理方法）→超濾（200 000）→超濾（100 000）→Protein Pak SW300

　　C、 細胞破壁→聚合物沉淀→透析

　　D、 細胞破壁（幾丁質酶等）→反向膠束系統。

　　上述幾條路線表明：為適應單寧酶商品化需求，單寧酶的提純技術在從復雜且成本高的實驗室提純手段向簡明的工業化生產過渡。Chantal報道的反向膠束系統可有效地提高酶產量，大大地縮短純化過程。反向膠束系統是80年代初期興起的一項蛋白質提純技術，它的基本原理是利用表面活性劑在有機溶劑中形成一個個膠團，極性基團向內排列，而形成極性區域，膠團內部能為酶提供最佳微環境，在熱力學上穩定且表面活性劑的性質和水含量最佳化時，反向膠束系統中的酶穩定性可大大提高。酶分子可容納于此，這樣酶分子就可與其他雜質分

　　開。與其他提純手段相比，反向膠束系統更適于工業化生產。

　　單寧酶活力測定方法

　　單寧酶活力測定方法有滴定法、紫外分光光度法、比色法以及高效液相色譜法, 各種方法基本原理簡述如下.

　　滴定法

　　由于單寧在單寧酶作用下分解生成游離的沒食子酸，可用堿對之進行滴定，確定底物單寧的減少量而測得酶活力。但是，因為緩沖液對堿的緩沖力以及單寧本身的褐色干擾了滴定終點，再者，隨溶液pH值增高，單寧會逐漸發生水解，將影響測定結果的穩定性與準確性。 紫外分光光度法

　　日本Sadaaki Iibuchi 等于1967年建立了紫外分光光度法，基本原理是通過測定底物單寧反應前后在紫外光區310nm處光密度的變化，求得單寧酶活力。這個方法成為以后單寧酶活力測定的經典方法。此法簡單快捷，且誤差在1%～3%之間，但底物單寧純度要求非常高。1995年, Sadaaki Iibuchi建立的紫外分光光度法基礎上，改建了單寧酶活力測定方法，以沒食 子酸丙酯(PG)為底物，在270 nm處,PG濃度在一定范圍內與吸光度成正比，根據此原理建立的酶活力測定方法，簡便靈敏，重復性好。

　　視讀法

　　1993年，澳大利亞科學家O saw e R.等建立了細菌單寧酶活力測定方法，其根據有兩點： a. 單寧可水解生成游離的沒食子酸；

　　b. 沒食子酸在空氣中暴露被氧化，顏色從綠色變成褐色。通過比色求其變化量而測得酶活力。

　　高效液相色譜法

　　1994年, 法國的Chantal Barthomeuf等用高效液相色譜法連續測定反應過程中產物沒食子酸變化量，直接測定出酶反應的初速度，此法迅速準確，但對儀器要求較高。

　　篇二：單寧酶

　　單寧酶及其在茶飲料中的應用

　　【摘 要】 單寧酶可水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，主要由曲霉屬等微生物發酵生產。單寧酶防止冷混濁、提高提取率、保持色澤和減輕苦澀味的作用在茶飲料工業中有廣泛的應用。

　　【關鍵詞】 單寧酶；茶飲料；應用

　　單寧酶又稱單寧酯酰水解酶（EC3.1.1.20），它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，可廣泛應用于制革、釀酒、醫藥、飲料等領域。 1單寧酶的性質和生產

　　1.1單寧酶的來源和性質

　　單寧酶除存在于富含單寧的植物中外，還廣泛存在于微生物中。能夠產生單寧酶的微生物來源十分豐富，主要是真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬，尤其是曲霉屬中的黑曲霉、米曲霉和黃曲霉；此外，酵母菌、寄生內座殼菌、巴斯德菌、茄形鐮刀菌和綠色木霉等也可產生單寧酶。

　　單寧酶是一種糖蛋白，不同來源的單寧酶其分子量和糖鏈的含量有所差異，酶蛋白由2-8個單體聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不同來源的單寧酶溫度和pH穩定性不同：最適溫度較高的50-60℃，一般在30-40℃之間，熱穩定范圍在60-70℃以下；來源于真菌和植物的單寧酶的最適pH一般為4.0-6.0，pH穩定性范圍一般是3.0-7.0之間，細菌單寧酶的最適pH一般偏中性[2]。金屬離子對單寧酶活性的影響也有所不同：Libuchi S等[3]發現許多離子對單寧酶無活化作用，但Zn2+和Ca2+可抑制酶活，另外EDTA溶液會使酶完全失活，而Aoki K[4]等發現EDTA對酶活無明顯影響。Rajakumar G S等[5]發現Cu2+，Zn2+，Fe2+，Mg2+均對酶活力有顯著影響。郭魯宏等[6]研究發現除了Mn2+，Zn2+抑制酶活之外，其它金屬離子對酶活均無明顯的激活或抑制作用。Kar B 等[7] [41]研究表明Mg2+、Hg+ 可提高單寧酶活力， Ba2+、Ca2+、Zn、Hg、Ag 會抑制酶活力，Fe、Co 完全抑制酶活。

　　1.2單寧酶的發酵生產

　　單寧酶是一種誘導酶，可由微生物在單寧酸存在的條件下誘導產生的，目前對單寧酶發酵生產研究的重點多集中在曲霉和青霉上，常通過誘變育種選育和改良生產菌株以及通過優2+++3+2+

　　化發酵條件等途徑來提高發酵產酶活力。如Libuchi等[1]以Asp oryzae為出發菌株，以單寧酶為誘導物，探討了菌株產單寧酶的最適培養條件。Aoki K等[4]以酵母屬的Candida sp K-Ⅰ為出發菌株，以單寧為誘導物，探討了培養的最適條件，發現添加了3%的單寧所得的單寧酶積累量最多。Bradoo S等[8]對產單寧酶的日本曲霉進行搖瓶發酵培養條件優化，將酶活力提高了13%。龔加順等[9]利用離子注入技術誘導得到一株單寧酶高產的9701菌株，其搖瓶培養的酶活力高達13.0l IU/ml，比出發菌株9401的酶活力高了2.89倍，且產酶性能穩定，重復性好；對另一株單寧酶高產菌株進行產酶條件優化后，獲得了53.58mo1/s的高產酶活力。王征等[10]對黑曲霉的產酶發酵條件進行優化研究，獲得316U/m1的較高酶活力。劉如石等[11]對黑曲霉NO.3菌株產酶發酵條件進行優化研究，最高酶活力可達144.25U/100mL發酵液，酶比活力為17.71。近期余鈞池等[12]采用先培養菌體后再誘導產酶的方式，在誘導劑濃度為1.5%，誘導培養基初始pH5.0，30℃培養48h的條件下，發酵米曲霉得到的單寧酶活力相當于167.4U/ml發酵液。

　　基因工程育種具有能定向、穩定遺傳、目的性強、育種周期短和能克服遠緣雜交的障礙等優點，國內外都開展了構建高產單寧酶基因工程菌的研究。Hatamoto O等[13]克隆了米曲霉單寧酶的基因，用3個脫氧核糖核苷酸探針按照單寧酶N-末端和內在的氨基酸序列合成了單寧酶基因。單寧酶低產菌株米曲霉AO1被包含單寧酶基因的質粒pT1轉化后，轉化株的單寧酶活力增加了，且與轉化的質粒數成比例。陳志仕克隆并分析了米曲霉單寧酶基因序列，構建了含單寧酶基因的載體，實現了在大腸桿菌（E.coli）和畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達。鄭穗蘭[15]改造了重組米曲霉單寧酶基因的表達質粒，成功地進行了基因表達框架的改造，通過轉化篩選獲得了轉化子并進行了搖瓶表達的初步摸索。ZHONG X F 等[16]研究了米曲霉單寧酶基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達，酶活力比出發菌株提高了3倍。由于天然菌生產單寧酶主要是通過曲霉屬微生物的發酵獲得，曲霉屬發酵工藝成熟、易于大規模的培養、成本低廉、副產物少、產物分離簡單，人們也對利用重組曲霉表達系統提高單寧酶的表達進行了嘗試。如黃小鳳等利用PCR擴增得到米曲霉單寧酶基因的編碼序列，然后將其連接到黑曲霉的表達載體ANED2-SP2上。將構建好的單寧酶基因表達載體通過原生質轉化法導入黑曲霉菌株ST31中，該重組菌株的單寧酶活力最高為104.02U/ml，比原始天然菌株提高了2-3倍。Tadashi T等

　　價值。

　　單寧酶的生產可采用固體發酵和液體深層發酵兩種方法。雖然固體發酵的設備要求比較簡單，易于推廣，但其缺點是容易污染雜菌；而液體深層發酵比較容易控制，不易污染雜菌，而且生產效率高，目前單寧酶的研究和生產多采用液體深層發酵的方法。 [18][17][14]將外源的DNA整合到大豆曲霉和米曲霉的染色體中，提高了在ku70 和ku80 基因斷裂過程中基因的中靶頻率，為單寧酶基因的`整合提供了參考

　　2單寧酶在茶飲料中的應用

　　2.1防止茶飲料的冷渾濁

　　在茶飲料的生產中，茶葉的高溫提取液冷卻后會變渾濁，并產生絮狀沉淀（茶乳酪）。茶葉提取液中固形物濃度越高，這種沉淀現象越嚴重，影響了茶飲料的穩定。此外，茶飲料在冷藏中也會變得渾濁，滋味和香氣都會產生很大的影響，這種現象使其作為冷飲的商品價值受到很大的損害。茶飲料產生茶乳酪沉淀的原因是茶水中的咖啡因與兒茶素或者是以茶黃素等為核心形成的不溶性復合物，防止產生沉淀的方法包括原料茶葉的選擇、適當的抽提條件、膜過濾處理、降低水溶性固形物的濃度等，也有采用添加PVPP進行處理。但不管是哪一個方法都會使茶葉的特有成分咖啡因和兒茶素類的含量下降，添加糖類雖然可抑制沉淀生成，但也存在增加熱量等問題。單寧酶是將茶乳酪轉溶的專一酶，它能斷裂兒茶酚與沒食子酸間的酯鍵，使苦澀味的酯型兒茶素水解，釋放出的沒食子酸陰離子又能與茶黃素、茶紅素競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶性短鏈物質，從而降低茶湯的混濁度[20]。Takino Y[21]利用米曲霉產生的單寧酶作用于6%的紅茶茶湯，發現單寧酶在茶湯pH 為5.6，溫度為45 ℃的條件下作用30-60分鐘后，茶乳酪產生最少。可口可樂公司利用單寧酶解決茶飲料中的“冷后渾”，取得了良好的效果，渾濁度由80%降至8%[22]。對紅茶進行單寧酶處理，結果發現速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而無酶處理的茶的固形物和浸提物產量均低于酶處理的茶[23]。日本專利J P3951260 報道：將提取物的溫度控制在單寧酶適宜溫度（20-80 ℃），添加酶量為每克干茶0.5～50單位，調整pH4.0～7.0，經酶處理的茶湯用分子量不少于5000道爾頓的超濾膜過濾，再經反滲透濃縮后，冷凍干燥即得冷水可溶的速溶茶[24]。近年來由于透明塑料瓶的大量使用，飲料的透明度比以往有更高的要求，單寧酶防止茶飲料產生冷渾濁的作用效果更加受到關注。

　　2.2提高茶葉的提取率

　　中森薰等[19][19]發現，與未用單寧酶處理的茶葉提取液相比，用單寧酶處理的提取液中，單寧的含量增加34%，咖啡因增加43%，而可溶性固形物也增加了24%，因而從茶葉提取出的多種成分能保(來自:WwW.zaiDian.com 在點網)持在提取液中，不被沉淀，使茶葉的提取率大幅度上升。單寧酶應用于紅茶、綠茶、烏龍茶深加工中, 還能使茶葉中可溶性金屬元素含量增加。Lauren S.等[25]報道，用單寧酶處理紅茶，茶湯中可溶性鐵、鈣的含量分別增加了23%與15%；若在綠茶加工中使用單寧酶，可使離子鐵的含量提高18%，并部分消除夏春茶的苦澀味，提高茶品質。Jakson 和Lee[20]研究報道，添加單寧酶處理茶湯，茶中的鐵、鈣、鎂和鋅等離子的溶解性會增加。單寧酶還可用以輔助茶葉抗氧化劑來對抗食品氧化，如Mai J等[26]報道用單寧酶處理的紅茶水

　　浸出物其抗氧化能力得到增強。

　　2.3保持茶汁的色澤和減輕苦澀味

　　通常茶飲料由于浸出后產生沉淀，就會使提取液中的固形物濃度下, 降而色澤變淡。單寧酶的作用提高了茶成分的得率，就能防止這種現象的發生。同時，由于茶葉中所含的咖啡因、維生素、兒茶素類物質具有多種生理功能，例如茶多酚類的抗氧化作用、抗菌作用等，通過單寧酶處理，提高茶葉有效成分的得率，也就提高了其功能性。美國斯福冰茶公司研究認為，在加工速溶紅茶的提取工序之前，將紅茶先用單寧酶和纖維素酶的溶液噴灑，然后將茶葉放入封閉系統中放置一段時間，不僅可提高原料的制取率，增加可溶性物質的含量，而且還能減輕一些苦澀味，增加茶葉的香氣。在綠茶、烏龍茶加工中的應用研究中也發現，加入一定量的單寧酶能降低酯型兒茶素的含量，從而消除夏秋茶的部分苦澀味道[22]。

　　3展望

　　單寧酶防止冷混濁、提高提取率、保持色澤和改善口味的作用在茶飲料工業中有廣泛的應用。如何采取更高效的方法培育高產菌株、提取單寧酶液，以降低成本，是單寧酶研究中的主要內容。此外，單寧酶如果是以水溶性酶的狀態進行作用，酶在整個反應系統中與底物、產物混在一起，難以回收利用。尋找合適的載體，將酶固定化，實現酶反應工藝管道化、連續化、自動化，將進一步降低生產成本，提高生產效率。

　　參考文獻

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　　篇三：陳春梅開題報告

　　楚雄師范學院

　　本科畢業論文（設計）開題報告書

　　題 目元江栲、漿果苔草對花椰菜、匍匐翦

　　股穎化感作用

　　姓 名 陳春梅

　　學 號20111052140

　　系（院）化學與生命科學學院

　　專 業 生物技術

　　指導教師 李天星（教授）

　　2015年 3 月10日

　　沿之一。研究表明，少數作物的大多數品種(系)能表現化感作用，如水稻、小麥、高粱、大麥和大豆等，因而這些作物在農業生態系統中常被認為是化感作物，而大多數作物只有少數品種能顯示化感效應。當前，作物化感品種資源的開發利用已取得較大的進展，其中水稻和小麥商業品種的開發已看到曙光。孔垂華曾經提到指植物所產生的影響其他生物生長、行為和種群生物學的化學物質，不僅包括植物間的化學作用物質，也包括植物和動物間的化學作用物質，而且這些化學物質并沒有被要求必須進入環境，也可以在體內進行。現已發現，許多化感物質不僅對植物，而且對微生物、動物特別是昆蟲都有作用。以花椰菜、匍匐翦股穎為受體，以沅江栲、漿果苔草為供體，展開它們之間化感作用的研究，會大大豐富化感作用的研究庫，推動化感作用的進一步發展，符合可持續發展的要求。下面是兩種供體元江栲與漿果苔草和兩種受體花椰菜和匍匐翦股穎的簡要介紹.

　　元江栲(castanopsis orlhacantha)，殼斗科，屬雙子葉植物,喬

　　木。生長于云南大部分地區，尤以滇中地區分布最普遍，是重要的水源涵養樹種之一。樹高達20米，胸徑達60厘米。花單性。殼斗近球形，內有堅果3枚。果期9－10月，種子繁殖。干種仁含淀粉66.76％、蛋白質2.86％、脂肪0.45％，可供食用及釀酒。是云南常見的淀粉植物和用材樹種。

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