談百合固金湯四逆湯含藥血清對TLR2和TLR4比值的影響論文

　　本項研究所用四逆湯為《傷寒論》之“經方”，百合固金湯典出明代《慎齋遺書》。此兩方之立方均據張仲景之“六經”辯證。且推其早年之“回陽救逆”和“滋陰養肺”功效均與感染性疾病有不解之緣。此兩方之藥理又恰為中醫“養陰”“回陽”治則之代表。故選此兩方為對照，觀察機體感染發生過程中，兩者對固有免疫調節之異同，極有可能揭示“養陰”“回陽”兩種治則對免疫細胞之實際作用。在基于經驗的中醫臨床治則和基于實證的現代免疫藥理之間牽起一線“姻緣”。

　　Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是表達于巨噬細胞表面的一類模式識別受體(pattern recognition receptor， PRR)，在固有免疫應答中發揮了重要的作用。研究發現TLR2與TLR4在炎癥信號轉導途徑中并非起協同作用，研究發現TLR2的表達能抑制TLR4信號的過度激活。故推測TLR2和TLR4可能是“養陰”“回陽”兩種治則對免疫細胞，尤其對固有免疫細胞的功能產生調節的重要物質基礎和藥理作用靶標。TLR2和TLR4是識別結核分枝桿菌的主要模式識別受體，此文選取臨床治療結核感染的百合固金湯和對感染性休克起治療作用的四逆湯為例，觀察兩方對RAW264.7細胞表面TLR2和TLR4比值是否存在影響，作為深入探討“養陰”“回陽”治則在抗感染作用研究中的引玉之磚。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物、細胞及細菌

　　體重(2.0±0.2)kg，健康雄性新西蘭大白兔10只，由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。結核分枝桿菌株H37Ra，引自上海復旦大學遺傳學研究所。

　　1.2 主要試劑

　　百合固金湯和四逆湯個飲片，均購自上海養和堂中藥飲片有限公司;慶大霉素注射液，購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院;DMEM高糖培養液、胎牛血清、胰酶，均購自Gibco公司;7H9、7H10培養基，均購自BD Difco公司;TRIzol試劑， 購自Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒及2×PCR Mixture， 購自TAKARA 公司;PCR 引物，由上海生工生物工程有限公司合成;FITC標記anti-mouse CD282(TLR2)熒光抗體與PE標記anti-mouse CD284(TLR4)熒光抗體及其同型對照，均購自于Biolegend公司;PCR-Fluorescent Probing試劑盒，購自凱杰生物工程(深圳)有限公司。

　　1.3 細菌培養

　　用含10%ADC的7H9培養液，在37℃恒溫培養箱中培養，每周觀察1次，一般培養1～2周可見瓶底有細菌顆粒生長，(10～15)d達對數生長期。取對數生長期細菌用不含血清的DMEM 培養液重懸，調整細胞密度為1×107 個/ml。

　　1.4 細胞培養

　　小鼠巨噬細胞RAW264.7按常規方法用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液，在37℃，5% CO2培養箱中培養，調整細胞密度為1×106 個/ml，以每孔2ml鋪于6孔板中，24h后用于后續實驗。

　　1.5 含藥血清的制備及細胞干預

　　各方按臨床用藥量乘以動物的體表面積系數求得相應給藥量，經常規方法煎煮，濃縮至10倍劑量置4℃冰箱備用。10只新西蘭大白兔隨機分為空白對照組(control，4只)、百合固金湯組(BGD，3只)和四逆湯組(SND，3只)。各用藥組按10ml/kg灌服相應藥液，對照組灌服等量生理鹽水。每日1次，連續4d。于最后一次灌胃1h后心臟采血(最后一次給藥前禁食不禁水12h)分離血清，同組動物血清混勻，56℃滅活30min后，經0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝置-80℃冰箱備用。將RAW264.7細胞密度調整為1×106 個/ml，每組設3復孔，2ml/孔鋪于6孔板常規培養24h后，各用藥組加入含10%相應含藥血清的DMEM 培養液繼續培養，對照組加入含10%空白兔血清培養液進行培養，24h后檢測各組TLR2、TLR4的mRNA 及蛋白表達量。

　　1.6 感染模型建立及藥物干預

　　模型組用含10%空白兔血清的培養液重懸沉淀細胞，分別作用24h和48h后進行相關指標的檢測。各含藥血清組及對照組按照細胞∶細菌為1∶10的比例加入用10%相應含藥血清培養液重懸的細菌，密度為1×107 個/ml的Mtb H37Ra，2ml/孔。

　　1.7 指標測定

　　TLR2與TLR4的mRNA表達以RT-QPCR 的方法檢測， 以GAPDH 作為內參，結果用2-△△Ct表示。TLR2與TLR4蛋白表達水平的檢測，以FACS檢測細胞表面TLR2與TLR4的表達百分比。細胞吞噬、殺菌能力測定，以QPCR檢測巨噬細胞內結核分枝桿菌DNA含量： 按照凱杰生物工程(深圳)有限公司的PCRFluorescent Probing試劑盒說明做標準曲線后計算各樣本中的結核分枝桿菌拷貝數。

　　1.8 統計學分析

　　所有數據以x±s表示，應用SPSS18.0軟件進行統計學處理，多組間比較采用單因素方差分析，二組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 百合固金湯和四逆湯

　　含藥血清對TLR2與TLR4 mRNA表達的影響及其比值的改變 表1結果顯示，與對照組相比，百合組RAW264.7細胞TLR2mRNA的表達沒有明顯差異(P>0.05)，但TLR4mRNA 水平較之上升明顯(P<0.05)，TLR2/TLR4 下調明顯(P <0.05); 四逆組RAW264.7細胞TLR2及TLR4mRNA的表達都明顯上升(P<0.05)，但TLR2/TLR4較之無明顯差異。兩用藥組之間比較TLR2、TLR4及TLR2/TLR4的差異均有統計學意義(P<0.05)。

　　2.2 百合固金湯和四逆湯

　　含藥血清對TLR2與TLR4蛋白表達的影響及其比值的改變 圖1、表2結果表明，與對照組相比，兩用藥組RAW264.7細胞表面TLR2和TLR4表達百分率均有上升，TLR2增加尤為明顯(P<0.05)，兩用藥組之間相比可見百合組TLR2 百分數較四逆組低(P <0.05)，但TLR4百分數較四逆組高(P<0.05)。表中結果顯示，與對照組相比，百合組tlr2 p="">0.05)，而四逆組TLR2/TLR4比值明顯高于空白組(P<0.05)，兩用藥組相比，四逆組TLR2/TLR4比值較百合組增長更明顯(P<0.05)。

　　2.3 百合固金湯和四逆湯含

　　藥血清對巨噬細胞吞噬殺菌能力的影響 QPCR法檢測巨噬細胞內結核桿菌DNA的表達水平，以細菌數量取lg10作統計處理，圖2顯示Mtb H37Ra與RAW264.7細胞作用24h和48hQPCR法檢測到的細菌含量差異，24h結果顯示三組之間無明顯差異，而48h的結果顯示百合組的細菌含量較其他兩組明顯減少(P<0.05)。各用藥組24h和48h的前后比較發現百合組較之對照組和四逆組其殺菌能力明顯提高(P<0.05)，提示百合固金湯抗癆作用可能與調節TLR2/TLR4比值相關。

　　3 討論

　　TLR是一種重要的PRR，能夠識別多種病原相關分子模式(PAMP)，TLR的研究已涉及到腫瘤，自身免疫性疾病，自身代謝性疾病及各種感染性疾病等多個領域。在目前發現的10種人類TLR中，TLR2與TLR4是其中研究得較為清楚的兩種。TLR2可廣泛識別多種病原相關分子模式，包括革蘭陽性菌的磷壁酸和肽聚糖、分枝桿菌胞壁組分、細菌脂蛋白、鉤端螺旋體的.LPS、酵母菌細胞壁等等，TLR4是第一個在哺乳動物發現的TLR，可以識別LPS、磷壁酸、熱休克蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白等配體。以往許多研究顯示TLR2、TLR4能夠啟動機體的固有免疫應答，對病原體發揮殺滅清除作用。通常認為TLR2、TLR4都可經MyD88(myeloid differentiation factor 88)途徑調控炎癥基因的轉錄。但也不排除兩者都存在有非MyD88依賴的轉導途徑。盡管多數文獻認為TLR2與TLR4在炎癥信號轉導途徑中起協同作用，但Finamore等對乳酸桿菌的研究時發現，TLR2在抑制TLR4信號過度激活的過程中有重要作用，可能成為抗炎治療的新的靶點。而早在2012年，國內就有過類似的報道，北京解放軍第306醫院消化內科曹艷菊用雙歧三聯活菌治療急性結腸炎模型大鼠，隨后檢測TLR2、TLR4及NF-κB的表達，結果發現益生菌組TLR2表達較模型組明顯增加，而TLR4表達明顯下降，NF-κB活性較模型組也明顯降低，提示益生菌可能通過進一步增加TLR2 的表達，并抑制TLR4的表達，進而調控NF-κB的活性，以緩解腸道炎癥。這些發現與本實驗所提供的研究結果似有類似之處，提示某些藥物或微生物確實可以誘導形成TLR2、TLR4表達的拮抗局面，并由此而影響感染與炎癥的發展與轉歸。

　　在本項研究的結果中，似乎可提示以四逆湯(附子、干姜、甘草)為代表的“回陽救逆”治則與以百合固金湯(百合、玄參、白芍、生地、熟地等)為代表的“養陰”治則在對感染過程中識別病原體的PRR表達類型可產生不同的調節格局，如本項研究所顯示。或許百合固金湯對TLR4表達增高的調節作用與其治療結核病的臨床功效有著內在聯系(啟動炎癥通路，清除細胞內的結核分枝桿菌);而四逆湯之增高TLR2表達的作用也是和其治療感染性休克的臨床作用不可分離(有可能通過TLR2/TLR4的拮抗作用，降低了TLR4對LPS的反應敏感性)。盡管這樣的推論與猜測還需要更多深入的研究去加以驗證，但目前的發現無疑是一個新的開端。這為中醫陰陽理論在感染性疾病的實踐應用中所取得的卓越療效提供了可能的科學解釋。

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