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談PTEN對苦參堿抑制LoVo細胞的影響論文

時間:2022-08-25 01:34:31 畢業論文范文 我要投稿
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談PTEN對苦參堿抑制LoVo細胞的影響論文

  苦參堿是中藥苦參中的主要生物堿類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗膽管瘢痕等多種生物活性。人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologd on chromosome 10,PTEN)是Li等在1997年發現的一種新的抑癌基因。苦參堿可通過滅活Akt通路抑制人結腸癌LoVo 細胞系增殖和誘導凋亡。本研究采用小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)技術沉默PTEN 基因,探討PTEN 在苦參堿抑制LoVo細胞增殖、遷移、侵襲及誘導凋亡中的作用,報道如下。

談PTEN對苦參堿抑制LoVo細胞的影響論文

  1 材料與方法

  1.1 一般材料

  結腸癌細胞系LoVo由哈爾濱醫科大學附屬第四醫院檢驗科實驗室惠贈。苦參堿(98%)(成都普菲德生物技術有限公司),DMEM 高糖培養基(Gibco公司),胎牛血清(浙江天杭科技有限公司),Lipofectamine 2000(Invitrogen公司),siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司),PTEN 抗體,Bax、Bcl-2抗體(北京中山金橋生物技術有限公司),p-Akt抗體(江蘇睿灜生物技術有限公司)。

  1.2 方法

  1.2.1 細胞培養

  LoVo細胞用含有體積分數10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液(含青霉素100u/mL和鏈霉素100mg/L),并置于37 ℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養。

  1.2.2 siRNA序列的合成及轉染

  在PTEN-siRNA3條序列中選取其中沉默效率最高的1條序列,序列為5’-CCAGUCAGAGGCGCUAUGUTT-3’;陰性對照組siRNA(NC-siRNA)序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。按吉瑪轉染說明書將PTENsiRNA與lipofectamine>TM2000混合形成轉染復合物,將轉染復合物與OPTI-MEM 培養液加入培養的細胞中,轉染24h后更換為含血清的DMEM 培養液繼續培養。

  1.2.3 實驗分組

  將LoVo細胞分為空白對照組、轉染組、轉染加藥組、陰性對照組、陰性轉染加藥組和加藥組。其中轉染組LoVo細胞轉染PTEN-siRNA,轉染加藥組轉染PTEN-siRNA 并加入苦參堿1mg/mL,陰性對照組轉染NC-siRNA,陰性轉染加藥組轉染NC-siRNA并加入苦參堿1mg/mL,加藥組不轉染但加入苦參堿1mg/mL,空白對照組不轉染不加藥。

  1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力

  空白對照組和轉染組細胞分別采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50mg/mL苦參堿處理,培養24、48、72h后分別加入MTT溶液20μL,繼續培養4h后棄上清,加入150 μL 二甲基亞砜振蕩溶解,酶標儀(SpectraMax M5)490nm波長下讀取吸光度(opticaldensity,OD)值。

  1.2.5 細胞遷移能力檢測

  將各組細胞分別以每孔2×105 密度接種于6孔板中,待細胞長滿時用200μL槍頭在每孔中垂直劃一道直線,吸取培養液,PBS清洗2次,更換新鮮不含血清的培養基,并分別用苦參堿(0、1.0mg/mL)處理,分別于0、24、48h后拍照,比較各組細胞遷移距離。

  1.2.6 細胞侵襲能力檢測

  將Matrigel基質膠用DMEM 完全培養基1∶8稀釋后均勻鋪在孔徑為8μmol/L的Transwell小室上表面,置于37℃培養箱中4h使之凝固。將已處理的各組細胞用胰酶消化后,分別用不含血清的培養基重懸,以2×105 個/孔密度接種于小室上室,下室加入含體積分數10%胎牛血清的培養液,繼續培養24h后用棉簽擦掉小室上表面未穿越的細胞,甲醇固定,質量分數0.1%結晶紫染色,隨機取5個視野200倍光鏡下拍照。

  1.2.7 Western blot檢測

  分別將培養48h的各組細胞收集起來,采用RIPA 裂解液提取蛋白,BCA 法進行蛋白定量。蛋白上樣SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后,將蛋白轉移到PVDF 膜上,置于PBST配置的質量分數5%脫脂牛奶中室溫封閉1h,加入一抗,于4℃孵育過夜,PBST洗滌后加入二抗(山羊抗兔IgG),室溫孵育1h,PBST洗滌后用化學發光試劑處理后顯影。

  1.3 統計學處理

  采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差(珚x±s)表示,采用方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

  2 結 果

  2.1 空白對照組和轉染組細胞殘余活性比較

  培養48h后,轉染組不同苦參堿濃度作用下細胞殘余活性均高于空白對照組(P<0.05)。隨苦參堿濃度升高,2組細胞殘余活性均降低。 空白對照組和轉染組細胞殘余活性比較 (珚x±s,%)。

  2.2 各組細胞遷移距離比較

  處理24、48h時,空白對照組細胞刮痕寬度長于轉染組、轉染加藥組,短于陰性加藥組和加藥組(P<0.05)。轉染加藥組、陰性轉染對照組、陰性轉染加藥組和加藥組細胞刮痕寬度長于轉染組(P<0.05),陰性對照組、陰性轉染加藥組和加藥組長于轉染加藥組,陰性轉染加藥組和加藥組長于陰性對照組(P<0.05)。陰性轉染加藥組細胞遷移距離與加藥組比較差異無統計學意義(p>0.05)。

  2.3 各組細胞穿膜數量比較

  與空白對照組相比,轉染組及轉染加藥組細胞穿膜數量均增加,陰性轉染加藥組和加藥組細胞穿膜數量均減少。

  2.4 各組細胞PTEN、p-Akt、bax、bcl-2蛋白表達水平比較

  空白對照組PTEN、Akt、bax蛋白表達量低于加藥組和陰性轉染加藥組,高于轉染組和轉染加藥組(P<0.05)。轉染組PTEN、bax蛋白表達量明顯低于空白對照組、加藥組和陰性轉染加藥組,高于轉染加藥組(P<0.05),與陰性對照組比較差異無統計學意義(p>0.05)。轉染組bc達明顯高于空白對照組、陰性對照組、加藥組和陰性轉染加藥組,低于轉染加藥組(P<0.05)?瞻讓φ战Mpten、akt、bax、bcl-2蛋白表達量與陰性對照組比較差異均無統計學意義(p>0.05)?瞻讓φ战Mp-Akt蛋白表達明顯低于轉染組和轉染加藥組(P<0.05),高于陰性轉染加藥組和加藥組(P<0.05),與陰性對照組比較無統計學差異(p>0.05)。

  3 討 論

  目前關于苦參堿抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡相關機制的研究較多,研究結果表明苦參堿通過抑制JAK2/STAT3 信號通路誘導膽管癌KMCH-1和MzChA-1細胞凋亡?鄥A可通過引發線粒體途徑抑制視網膜母細胞瘤SO-Rb50細胞生長及誘導凋亡。但關于PTEN在苦參堿抑制腫瘤細胞生長促進凋亡中的作用的研究較少。本研究應用siRNA技術對結腸癌LoVo細胞PTEN 基因進行研究,比較沉默PTEN前后及聯合苦參堿處理后LoVo細胞的生長情況,結果表明在沉默PTEN 基因后,苦參堿抑制LoVo細胞的增殖作用明顯減弱,遷移和侵襲能力明顯增強,未經PTEN-siRNA轉染單純使用苦參堿處理的LoVo 細胞遷移和侵襲能力均減弱。

  Western blot結果顯示加藥組PTEN表達明顯高于空白對照組,轉染加藥組PTEN 水平高于轉染組,提示苦參堿可上調PTEN 表達水平,當沉默PTEN 時,p-Akt表達水平明顯上調,說明PI3K-Akt信號通路被激活并抑制細胞凋亡。PTEN作為PI3K-Akt信號通路的負向調節因子,可抑制PI3K-Akt信號通路激活并促進腫瘤細胞凋亡。當PTEN 基因被沉默、突變、滅活時可激活PI3K 的效應器,尤其是激活Akt,進而引起腫瘤發生。研究結果表明,人類惡性腫瘤中Akt活性明顯增強,Akt的活化對腫瘤的發生、發展起重要作用。

  Bcl-2是重要抗凋亡基因,bax是重要促凋亡基因,Bcl-2可與促凋亡基因Bax形成二聚體,如Bax相對量高于Bcl-2,則Bax同二聚體的數量增多,從而促進細胞死亡;如Bcl-2相對量高于Bax,則促進形成Bcl-2/Bax異二聚體,并使Bcl-2同二聚體的量增多,從而抑制細胞死亡。本研究結果顯示,加藥組中bax表達高于空白對照組,bcl-2表達低于空白對照組,提示苦參堿可誘導bcl-2表達水平下調、誘導bax表達水平上調,PTEN基因沉默時,苦參堿對2種蛋白的表達水平呈相反作用,抑癌基因PTEN在苦參堿抑制LoVo細胞增殖、遷移、侵襲及誘導凋亡中起關鍵作用,苦參堿抑制LoVo細胞增殖、遷移、侵襲及誘導凋亡的機制是通過PTEN-Akt信號通路。本研究結果提示,PTEN可能成為結腸癌治療的新靶點,為苦參堿研發成抗腫瘤新藥提供了實驗依據。

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