大黃素甲醚對抑郁大鼠海馬ERK、cAMP、CaMK 的影響論文
目前抗抑郁藥在治療抑郁癥時都有幾個共性，如起效遲緩、需長期服藥，只有約60%～70%的患者有效等。大黃素甲醚有抗抑郁作用，與抑郁相關的信號通路的調節(jié)是抗抑郁藥長期作用的一個中心環(huán)節(jié)，本研究在前期動物實驗基礎上采用慢性輕度不可預見應激(CUMS)大鼠抑郁模型，以海馬細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)，環(huán)磷腺苷(cAMP)，鈣離子依賴的蛋白激酶(CaMK)信號通路為切入點，探討大黃素甲醚的抗抑郁作用機制。
1材料和方法
1.1試驗
藥物大黃素甲醚(標準品)由成都普思生物科技有限公司提供，純度:95%，百優(yōu)解，禮來蘇州制藥有限公司，批號J20120001，臨用前用蒸餾水配制為混懸液。
1.2動物雄性SD大鼠，體重180g～220g，購于簡陽達碩動物科技有限公司，合格證號:SCXK(川)2014-189。
1.3試劑
ERK試劑盒，貨號:20140630LC，cAMP試劑盒，貨號:20140622SA，CaMK試劑盒，貨號:20140630LK，均由Abcam公司生產，北京永輝生物科技有限公司進口分裝。
1.4儀器
酶標儀:型號:MultlskanMk3，賽默飛世爾儀器有限公司生產，大鼠開場實驗箱100cm×100cm木箱(自制)，底部等分為25個20cm×20cm小格。轉輪式切片機(徠卡-2016，德國);數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)等;圖像分析軟件MoticImagesAdvanced。
1.5方法參照文獻
稍作改進，將60只SPF雄性大鼠，隨機分成2組:空白組10只，模型組50只。模型組的大鼠造模2周后，按體重和開場實驗結果隨機分為模型組、百優(yōu)解組、大黃素甲醚高中低劑量組。刺激因子包括14種:水平震蕩(30次/min，1min/d)、電刺激(0.1mA，1min/次×10次)、噪音(10dB，1min/次×10次)、通宵照明(日光燈24h)、冰水游泳(4℃，5min)、禁食(24h)、鼠籠傾斜(45°12h)、熱刺激(45℃烘箱，5min)、潮濕墊料(將200ml水加到有墊料的籠底)、禁水(24h)、禁食禁水(24h)、異物放置(100g沙子24h)、明暗循環(huán)(4次，30min/次)、異味刺激(0.6%冰醋酸24h)。每日安排1種刺激，使動物不能預料刺激的發(fā)生，共造模6周。造模第3周開始給藥至第6周結束，共給藥4周，空白組及模型組給予等容積蒸餾水。
1.5.1開場實驗將大鼠放入自制大鼠開場實驗箱的中心位置，適應2min后，觀察隨后4min內大鼠的爬行格子數、站立次數。徹底清潔實驗箱之后再進行下一只大鼠的觀察。為避免每周進行而動物產生適應性，開場實驗分別在大鼠分組前、造模2周及6周后進行，共3次。
1.5.2糖水消耗實驗造模前一周對大鼠進行2次1%糖水偏好訓練，然后在造模前1天和造模后每周固定時間測定1次，共計7次。糖水偏好訓練和測試均于大鼠禁食禁水24h后進行，時間為下午14:00～15:00。以大鼠的糖水偏愛百分比(糖水消耗量/總液體消耗量×100%)作為評價指標。
1.5.3大鼠海馬ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量測定取海馬，-80℃冰箱保存，第二天測指標。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定海馬ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠ERK、cAMP、CaMK水平。用純化的大鼠ERK、cAMP、CaMK抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加ERK、cAMP、CaMK與HRP標記的ERK、cAMP、CaMK抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ERK、cAMP、CaMK呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中大鼠ERK、cAMP、CaMK濃度。
1.5.4大鼠腦組織病理形態(tài)學的觀察參照大鼠腦組織定位圖譜取大鼠腦組織，10%中性甲醛固定，經過不同濃度乙醇梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，常規(guī)光鏡觀察，顯微鏡照相。
2結果
2.1大黃素甲醚對CUMS模型大鼠爬行格子數和站立次數的影響__結果表明，在CUMS造模程序連續(xù)實施的6周，與空白組比較，模型組的大鼠在開場實驗中的.爬行格子數和站立次數表現出低下，提示該模型的有效性和持續(xù)性。與模型組比較，大黃素甲醚能對抗該程序對動物運動能力和探究能力的抑制作用。
2.2大黃素甲醚對CUMS模型大鼠糖水消耗量的影響結果表明，CUMS程序實施后，模型組與空白組比較，大鼠糖水消耗量顯著減少;CUMS程序實施6周，模型組的大鼠糖水消耗量仍然顯著低于空白組。提示CUMS程序的應用能引起動物的快感缺乏，該模型的有效性和持續(xù)性。大黃素甲醚給藥1周(造模第3周)對模型組的大鼠糖水消耗量無顯著影響;連續(xù)給藥2周(造模第4周)，大黃素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量;連續(xù)給藥4周(造模第6周)，大黃素甲醚能提高模型大鼠的糖水消耗量，無統(tǒng)計學意義。
2.3大黃素甲醚對CUMS模型大鼠海馬細胞外信號調節(jié)激酶，鈣離子依賴的蛋白激酶，環(huán)磷腺苷蛋白含量的影響與空白組比較，模型組海馬海馬ERK、cAMP的蛋白含量減少，CaMK的蛋白含量增加，與模型組比較，大黃素甲醚能增加海馬ERK、cAMP的蛋白含量，減少CaMK的蛋白含量。
2.4大黃素甲醚對CUMS模型大鼠腦組織病理形態(tài)的影響與空白組比較，模型組灰質區(qū)細胞層次欠清楚，神經細胞(錐體細胞)似減少，排列較亂、密集，部分退變的神經元為紫藍色小體(密集嗜堿性深染不規(guī)則梭形結構)，細胞漿、核不清，膠質細胞增生;白質區(qū)灶性致密紅染(可能為神經纖維變性所致)，可見退行性病變。與模型組比較，大黃素甲醚腦灰質、白質區(qū)組織結構正常，灰質區(qū)細胞層次可見細胞數量基本正常，退變的神經元嗜堿性深染不規(guī)則梭形結構可見，數量較模型組少，皮質表層水腫，組織裂開，細胞間可見棕色細顆粒物，膠質細胞數量較多，病變總體較輕。
3討論
研究表明，與抑郁相關的信號通路及轉錄因子的調節(jié)是抗抑郁藥長期作用的一個中心環(huán)節(jié)。而環(huán)磷酸腺苷反應原件結合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB)是這些相關信號通路中的一個交匯點，對胞內的生化過程有著重要的影響。新的研究提示，CREB相關信號通路的激活，可能在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁藥作用機制中起重要作用。多種不同的信號轉導通路可以CREB磷酸化，CREB可被cAMP系統(tǒng)中的PKA磷酸化，被CaMK和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的核糖體S6激酶磷酸化。這3種CREB的磷酸化方式是目前研究認為與抑郁癥和抗抑郁藥作用相關的3條通路，而CREB正是上述通路的交匯點。
ERK為MAPK信號轉導介質家族的一員，主要調節(jié)細胞的生長和分化，ERK與記憶和突觸可塑性關系密切，ERK通過磷酸化CREB而調節(jié)CREB的活性，參與了記憶和長時程增強(LTP)的調控。腦內ERK1/2活性和表達的改變引起抑郁癥的發(fā)生。結果顯示，慢性應激引起大鼠海馬ERK蛋白含量降低，ERK活性降低削弱其對CREB的調節(jié)能力，引起CREB磷酸化水平降低，進而損害了長時記憶和LTP的形成。但具體機制需要更詳盡的研究加以闡明。
CaMK信號通路在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁治療途徑中具有重要作用。另有研究證實，CaMK在鈣信號轉導通路中起著軸心的作用，是CaMK通路上關鍵因子，其蛋白表達變化反映了CaMK通路的活性，CREB磷酸化→調節(jié)基因轉錄→生物效應。可能通過抑制CaMK信號轉導通路活性而發(fā)揮其抗抑郁效應。cAMP通路，在情緒調節(jié)中起重要作用，是研究得最早、最為深入的抗抑郁藥信號轉導通路，是細胞內普遍存在的一種信號轉導通路，許多胞內的生化反應機制都是其啟動或參與的。多數抗抑郁藥可以引起腦內5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)濃度增加，5-HT和NE與G蛋白偶聯(lián)受體結合，激活cAMP通路。
本研究采用采用酶聯(lián)免疫吸附法測定海馬ERK、cAMP、CaMK蛋白含量，結果顯示，CUMS造模程序可使大鼠海馬ERK、cAMP的蛋白含量減少，CaMK的蛋白含量增加，進一步證實了信號轉導通路的變化在抑郁癥發(fā)病機制中的作用，大黃素甲醚能增加CUMS大鼠海馬ERK、cAMP的蛋白含量，減少CaMK的蛋白含量。綜上所述，大黃素甲醚具有抗抑郁作用，其機制通過影響海馬ERK、cAMP、CaMK的蛋白含量，改善受損傷的腦組織，可能通過調節(jié)與抑郁癥相關的3條通路，使CREB磷酸化，關于大黃素甲醚對這3條通路的交匯點CREB有無作用還需做進一步的研究。
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